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玉米基因組編輯團隊在堿基編輯PAM拓展技術方面再獲新進展

發布時間:2020/8/2 15:17:40   閱讀次數:


 堿基編輯技術(Base editing)是基于CRISPR/Cas系統發展起來的新型靶基因編輯技術,在2017年被Science雜志評為年度十大科學技術突破之一。由于單堿基基因編輯器不引入雙鏈DNA斷裂,被認為比傳統方法更加高效而安全。SpCas9是目前最廣泛的核酸酶,其技術參數也已被詳細研究和報道。來源于金黃色葡萄球菌Cas9的變體SaKKH(識別NNNRRT PAM),可以識別SpCas9及其變體包括xCas9和Cas9-NG均不能識別的HHHAAT (H = A, T, or C) PAM。但到目前為止,無論是植物中還是動物中,SaKKH-CBEs的技術參數,包括堿基編輯窗口,編輯窗口內C兩側堿基的偏好性以及單位點堿基編輯效率最高的C所處靶點位置等都沒有明確詳盡的研究結果,因此,極大的限制了SaKKH-CBE的實際應用。

 近日,北京農林科學院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室基因組編輯團隊在The Crop Journal(IF=3.179,中科院Q1期刊)上發表題為“Highly efficient CRISPR-SaKKH tools for plant multiplexcytosine base editing”的研究論文,建立了基于金黃色葡萄球菌Cas9變體SaKKH實現多重靶點編輯的胞嘧啶堿基編輯器,明確了該堿基編輯器的多項技術參數,并通過改造SaKKH專用sgRNA骨架結構實現了該編輯器的效率增加。

 

 本研究首先建立了基于tRNA-sgRNA系統的多重靶點胞嘧啶堿基編輯器SaKKHn-pBE,結果表明其能夠編輯含有NNARRT, NNCRRT, NNGRGT和 NNTRGT PAM的靶點。進一步,該研究通過綜合分析27個有效編輯靶點的堿基突變情況,明確了SaKKHn-pBE的主要技術參數,例如,其堿基編輯窗口為靶點1-15bp,主要集中在4-9bp;SaKKHn-pBE編輯窗口內C兩側堿基的偏好性:5‘端偏好堿基為T和C(CC > TC >> GC > AC),3’端偏好堿基為G(CG>CA≈CC>CT);尤其值得一提的是,SaKKHn-pBE堿基突變類型主要為單堿基突變,且絕大部分靶點內單位點堿基編輯效率最高的C都獲得了單堿基突變體。最后,基于SaKKHn-pBE效率普遍偏低的情況,該研究還通過優化Sa-sgRNA的骨架結構進一步提高了SaKKHn-pBE堿基編輯效率。該項工作為SaKKHn-pBE工具應用于水稻基礎研究或分子育種中奠定了基礎,且可為其他植物或動物提供參考。這是玉米基因組編輯團隊繼之前利用SaCas9、xCas9和Cas9-NG進行基因編輯PAM拓展之后,進一步增加了基因組編輯技術應用范圍,實現了行業領先的植物PAM識別譜,為在更廣泛的植物基因組范圍內進行基因組編輯提供了可能。

 

 張成偉為本文第一作者,楊進孝為本文通訊作者。本研究得到北京學者(BSP041)項目資助。玉米基因組編輯團隊是2017年由玉米DNA指紋及分子育種重點實驗室引進建設的技術創新團隊,目前主要聚焦于堿基編輯、精確替換、組學編輯及其在玉米和水稻等作物中的高效應用。該團隊自引進以來已在國際學術期刊上發表多篇高水平研究論文。

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